В 1834 г. был открыт Киевский университет. 28 августа (9 сентября) 1834 г. начались занятия на философском факультете, имевшем два отделения: историко-филологическое и физико-математическое, а через год — на юридическом. Преподавание в Киевском, как и в других университетах страны, велось в то время на русском, латинском и французском языках. Первым его ректором был назначен воспитанник Московского университета, работавший там профессором ботаники, ученый с энциклопедическими знаниями М. А. Максимович. Именно в Киеве, естествоиспытатель по специальности, он, заведуя кафедрой русской словесности, раскрыл свой талант в области общественных наук. Максимович впервые ввел в университетскую программу преподавание древнерусской литературы и фольклора, в частности украинского, написал большое количество работ, посвященных древнерусскому, русскому, украинскому языковедению, а также вопросам общеславянской филологии. Значительный вклад сделан им в развитие отечественной истории, археологии, литературоведения. В 20— 40-е гг. Максимович подготовил и издал три сборника украинских народных песен. Их выход в свет был не только выдающимся событием в славистике, но и способствовал развитию глубокого интереса передовой общественности к народному творчеству.

Большинство из 13 созданных вначале кафедр (на историко-филологическом отделении — пять, а на физико-математическом — восемь) университета возглавили профессора бывшего Волынского (Кременецкого) лицея.

В 40—50-е гг. университет испытывал большие затруднения из-за недостатка преподавателей, особенно профессоров. На юридическом факультете преподавали воспитанники петербургских вузов — К. А. Неволин, С. М. Орнатский, А. А. Федотов-Чеховский, Б. А. Цветков и киевский профессор Н. Д. Иванишев. В университете работали окончившие Харьковский университет профессора: истории — В. Ф. Цых, Н. И. Костомаров, математики — Н. А. и А. А. Дяченко, астрономии И. И. Федоренко и др. В 1847 г. преподавателем рисования в университет был назначен Т. Г. Шевченко.

В год открытия университета в нем обучалось только 62 студента, из них 57 были детьми дворян, пять — зажиточных горожан и духовенства. Университет имел кабинеты: физический, химический, зоологический, минералогический, нумизматический и др., а также ботанический сад, типографию. Библиотека насчитывала 44 552 тома книг на разных языках мира. На базе закрытой Вильнюсской медико-хирургической академии в 1841 г. в Киевском университете был открыт третий факультет — медицинский, насчитывавший десять кафедр и укомплектованный профессорами Московского, Харьковского, Вильнюсского, Дерптского, Казанского университетов. Первым деканом медицинского факультета был ученик Н. И. Пирогова, один из основоположников отечественной офтальмологии профессор В. А. Караваев. В 1850 г. философский факультет разделился на историко-филологический и физико-математический. К этому времени в университете обучалось уже свыше 650 студентов.

Социальный состав студенчества университета в первой половине XIX в. ограничивался дворянско-чиновничьим сословием. Так, например, в 1838 г. из общего числа 267 студентов сыновей дворян насчитывалось 235, а в 1855 г. из 808 — 643. Эти сведения стали известны всей России благодаря великому русскому революционеру-демократу Н. Г. Чернышевскому. опубликовавшему их в 1856 г. в «Современнике».

Учебно-воспитательный процесс и научно-исследовательская работа в стенах университета проходила в тяжелейших условиях жандармско-казарменного режима. Но постепенно роль Киевского университета как крупного общероссийского центра науки и культуры, вопреки реакционным планам и действиям царизма, неуклонно возрастала.