Польско-шляхетская экспансия на украинские земли, особенно усиливавшаяся после Люблинской 1569 г. и Брестской церковной 1596 г. уний, принесла новое усиление феодально-крепостнического гнета народных масс. Шло также общее наступление на города Украины, ограничивались их права и привилегии. Правительственные чиновники и шляхта постоянно вмешивались в дела киевского магистрата, нарушали действующие нормы магдебургского права. На трудящихся города — мелких ремесленников и торговцев, казаков и крестьян предместий — легло тяжелое бремя феодальных повинностей и налогов. Несмотря на трудности и препятствия, чинимые королевским правительством Речи Посполитой, в экономической жизни города наблюдались положительные изменения. В Киеве возник ряд новых специальностей ремесленников, объединившихся в цехи, развивалась торговля и промыслы. В конце XVI — начале XVII в. увеличивалось количество населения города. Киев превратился в крупнейший торгово-экономический центр Поднепровья и всей Украины. Определенных успехов достигла также культурная жизнь города. Древнерусские традиции стали основой, на которой развивались литература и изобразительное искусство, архитектура и книгопечатание. Киевский коллегиум был не только центром сосредоточения лучших педагогических и научных сил на украинских землях, но и в славянском мире. Писатели-полемисты, группировавшиеся вокруг братства и коллегиума, внесли существенный вклад в борьбу против католицизма и унии, воспрепятствовали проведению в жизнь коварных замыслов и планов Ватикана.

Вторая половина XVI — первая половина XVII в. характеризуются дальнейшим укреплением экономических, общественно-политических и культурных связей Киева с Русским государством. Охватывая все сферы, они становились более стабильными, жизненно необходимыми для нормального функционирования городского хозяйства.

В ответ на жесточайший социальный и национально-религиозный гнет Речи Посполитой украинский народ с оружием в руках поднялся на борьбу против иноземных поработителей. В общем русле антифеодального и освободительного движения шло также трудящееся население Киева. В городе неоднократно вспыхивали народные волнения. Ремесленники и мелкие торговцы, казаки в крестьяне окрестных сел поднимались на восстания, громили дома и усадьбы городского патрициата и шляхты, уничтожали представителей господствующего класса. Тысячи киевлян приняли самое активное участие в крестьянско-казацких восстаниях 20—30-х гг. XVII в., ставших прологом освободительной войны украинского народа 1648—1654 гг. и воссоединения Украины с Россией.